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激光扫描共聚焦显维镜定量分析的优势和注意事项

更新时间:2010-01-22      点击次数:2500

激光扫描共聚焦显微镜与图像半定量分析相比,具有以下优点:
 
    1.更精细、度更高。激光扫描共聚焦显微镜对免疫荧光组织化学染色样品做定量分析时,利用激光聚焦和系统软件分析对组织进行深层扫描,不破坏组织细胞结构,可深层次准确定位并定量。而一般图像分析只是以荧光灰度的差别变化进行半定量分析。
 
    2.激光扫描共聚焦显微镜一般有两个以上不同波长的激光管,只要将标本标记上不同波长的荧光,就可以在同一张切片上同时分析两种或更多不同指标的变化,并比较它们之间的比值变化,而又方便,这一特点是一般图像分析*的。
 
    3.激光扫描共聚焦显微镜可根据需要提供纯荧光、白光以及荧光与白光合成图像等多种图像,远远优于一般图像分析。
 
    4.以往免疫荧光染色多要求冰冻新鲜组织标本,用石蜡切片在普通荧光显微镜下观察,常因背景非特异性荧光过强影响观察结果。而石蜡标本来源广泛,适用于回顾性研究。激光扫描共聚焦显微镜可扫描石蜡切片的荧光染色,可避免因背景非特异性荧光过强而影响观察结果,从而可获得清晰图像,这也是激光扫描共聚焦显微镜的优势所在。
 
激光扫描共聚焦显维镜定量分析的注意事项
 
《一》制备高特异性和价的荧光抗体
 
    标本只有在用荧光探针标记的前提下才能进行共聚焦显微镜检测.制备高特异性和价的荧光抗体是检测的关键。这就要求选用高质量的荧光素和高特异性与价的免疫血清。同时还要对荧光抗体进行质量鉴定,主要是进行特异性和敏感性鉴定。
 
《二》标本制作要求
 
    1.标本厚度  组织切片或其他标本不能太厚,否则激发光多数消耗在标本下部,而物镜观察的上部不能被充分激发。
 
    2.载玻片  载玻片要光洁,无自发荧光;载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间,太厚会吸收较多的光,不能使激发光在标本上聚焦。
 
    3.封固剂  甘油必须无色透明,无自发荧光。由于荧光在pH 8.5~9.5时较亮,不易很快退去,常用甘油加入0.5mol/lpH 9.0~9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液封片。
 
《三》定量研究的要求
 
    1.随机性
    (1)在感兴趣区域内随机抽样,不能主观地选择一些便于定量的“理想切片”,这种“理想切片”不能代表所要研究的整体区域。
    (2)在随机抽取的切片上,应随机抽取观察视野。
    (3)在随机抽取的视野中,通过连续观察“光学切片”,得到感兴趣结构的三维定量信息。如果不能连续观察“光学切片”,需要在Z轴方向随机抽样,然后作定量研究。
 
    2.避免参照陷阱  如果获得的资料是密度信息,当比较各组参照空间(包含待测结构的区域)的体积不同时,根据密度信息可能得出错误结论。因此,需要注意所谓的参照空间“陷阱”问题。
 

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